离子交换层析是目前生物大分子分离纯化最有效的手段之一，其原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离的层析技术。离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，常规分离条件的选择依据是等电点参数。然而，等电点仅仅是生物质表面净电荷为零时的溶液pH，无法确定生物表面电荷随pH、离子强度等环境变化的相关信息，因此分离过程的优化往往不得不在层析柱上反复摸索，从而达到最佳的分离效果。离子交换层析参数的选择往往从以下四方面入手：

1）离子交换填料的选择

首先，离子交换树脂可区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。阳离子树脂又分为强酸性和弱酸性两类，阴离子树脂又分为强碱性和弱碱性两类（或再分出中强酸和中强碱性类）。离子交换树脂的基体种类分类可分为苯乙烯系树脂、丙烯酸系、树脂环氧系、酚醛系及脲醛系等。树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。树脂孔型可分为凝胶型和大孔型。凝胶型树脂的高分子骨架，在干燥的情况下内部没有毛细孔。它在吸水时膨胀，在大分子链节间形成很微细的孔隙，通常称为显微孔。这类树脂较适合用于吸附无机离子，不能吸附大分子有机物质。大孔型树脂是聚合反应时加入制孔剂，形成多孔海绵构造的股骨架，内部有大量永久性的微孔，能够像活性炭那样吸附各种非离子性物质。

在已知蛋白pI的情况下根据流动相pH大于pI目的蛋白带负电，用阴离子交换。流动相pH小于pI目的蛋白带正电，用阳离子交换。对于常规大小目的蛋白60kD，通常使用Q、DEAESepharoseFastFlow作为阴离子填料，使用SP、CMSepharoseFastFlow作为阳离子填料；对于分子量较大的目的蛋白60kD，通常使用DE52、MonoQ等作为阴离子交换填料，使用CaptoS、UNOsphererapidS等作为阳离子交换填料。


2）固定相--配基密度、介质孔径

对于固定相来说，配基密度和介质孔径是最关键的因素，配基密度决定了经典相互作用的强弱，对目标蛋白的静态吸附、动态吸附和吸附动力学都有较大影响。研究表明，对于特定的目的蛋白，配基密度并非越大越好，增加配基密度可以提高蛋白吸附的可能性，但会带来介质内部的空间位阻，增加传质阻力。而介质孔径则影响蛋白质的孔内传质，对于生物大分子尤为重要。随着配基密度的增加与孔径的减小，饱和吸附量总体呈上升趋势；配基密度增大使解离常数有所下降，使洗脱蛋白更加困难，总之，树脂颗粒大小对交换速度有很大影响。一般小颗粒树脂总是有相对大的交换速度。因为：（1）小颗粒增大了树脂的比表面，单位时间内可以有更多的离子达到单位质量树脂的表面，从而增大总的膜扩散速度；（2）则小颗粒使离子通过的路程缩短，从而加快了过程的速度。注意：颗粒均匀的树脂比不均匀的树脂交换速度高，因为其中大的颗粒数目少。

对于固定相的选择，我们可以根据蛋白空间结构与大小的不同选择粒径不同的固定相：如交联琼脂糖直径90μm、交联聚丙烯酰胺直径80μm、聚甲基丙烯酰胺直径2μm、具有穿透孔隙的苯乙烯-二乙烯苯直径50μm。


3）流动相--zeta电位的因素

由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的反号离子，这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散双电层。根据Stern双电层理论可将双电层分为两部分，即Stern层和扩散层。Zeta电位的重要意义在于它的数值与胶态分散的稳定性相关。其值不仅与微粒表面的电化性质相关，还收周围溶液环境因素的影响，如：pH、离子强度、表面活性剂等。

溶液pH值会影响微粒表面带电基团的离子化程度，从而改变表面电势和zeta电位值，假设微粒表面带有正电荷，随着pH增加微粒表面正电荷减少，zeta电位也会随之降低，反应在纯化过程中即为pH梯度纯化，可能在洗脱的最后梯度无法分开；


4）纯化因素的考量

用层析法进行下游纯化，每一步需要考虑的有关经济效益重要因素有：纯度、载量和凝胶的使用寿命。由于介质的基架不同，在工艺优化过程中，凝胶表面的化学性质起着非常重要的作用。NaOH被用来消毒和清洗离子交换介质，可使细菌、病毒和酵母失活，破坏内毒素溶解脂类化台物。所以，介质的清洗与消毒，即在碱性条件下的稳定性，是选择介质的重要的因素。尽管不同凝胶对标准蛋白质的载量已有研究，但是使用寿命的研究结果，即介质在NaOH中可进行多少次CIP(在位清洗)循环，才失去对蛋白质的结合能力，并未有公开发表。Q／SPsepharoseFastFlow可用于循环操作1000次而无变质现象。

常规纯化中通常遵循四条原则：1.上样盐浓度为10-100mM的缓冲液，其电导率一般为1-4mS/cm；2.选择缓冲液的pKa应接近所选pH，最多只能有1个单位的pH偏倚；3.缓冲液本身不能与离子交换剂结合，如乙酸盐或Tris，所以最好不要用乙酸盐做阴离子层析，也不要用Tris做阳离子层析；4.当蛋白质接近离子交换剂表面时，可能会暴露于不同的pH，可能会由于氢离子和氢氧根离子导致pH有不同程度（约1左右）的升高或降低，这就是明明确定了pI但是目的蛋白不挂柱的常见原因之一；