大家还在用传统的双酶切系统在做载体构建吗？目的片段酶切，载体酶切，寻找多克隆位点，连接反应。。。。前前后后做几天还没几个阳性克隆，一不小心从头开始。。。



正所谓分子克隆虐我千百遍，我待它仍如初恋。如果你还不知道无缝克隆技术就OUT啦！无需酶切，连接，无需载体去磷酸化，简单的引物设计，一步到位的重组反应，还能多片段组装，集万千宠爱于一身的无缝克隆技术，你不能不知道，让我们来看下吧！


基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。
无缝克隆试剂盒，一次反应可完成单至多个DNA片段的重组，最快仅需5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%，能够一定程度上耐受未纯化PCR产物中含有的杂质。实验流程如下：



第一步：线性化克隆载体的制备
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。
•酶切制备
推荐使用Absin快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景(假阳性克隆)；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。
注意：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；酶切完成后应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
•反向PCR扩增制备
为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCRMix进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。
如下图所示，在克隆载体插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段即可。



第二步：PCR获取目的片段
获取目的片段首先我们要对插入的片段进行引物设计，然后在相应的模板中进行目标片段的扩增和回收即可。
•PCR引物设计
PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐18nt）序列。插入片段正向扩增引物：5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3'；插入片段反向扩增引物：3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'
注意：尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25nt区域内GC含量为40%~60%时，重组效率最高。



如下图所示在不同的载体末端引物设计的说明，假如载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。



•目的片段的PCR扩增
推荐使用高保真PCRMix进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。


第三步：无缝克隆反应
按照一定的比例将线性化载体、目的片段混合在LightNingDNAAssemblyMixPlus的预混液内，50℃反应5-60min后（单片段最快5min完成重组）直接转化即可。



注意：插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15min；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30min；当载体骨架在10kb以上或插入片段在4kb以上时，建议延长反应时间到30~60min；50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。


通过以上的三步就可完成质粒重组，只需要再进行后面的转化感受态等等操作，就可以完成载体构建实验啦。哇哦~~简直不要太好用，引物设计简单，实验操作简单，阳性克隆率高，想连哪里连哪里，多个片段也没有问题，麻麻再也不用担心我的学习！